Elektroforéza
Elektroforéza znamená migrácia iónov v elektrickom poli. Ide o široko používanú metódu separácie biomolekúl (predovšetkým DNA a proteínov) podľa ich veľkosti, náboja či väzbovej afinity, ktorá sa používa analyticky, aj na preparatívne účely. Elektroforetická separácia je usporiadaná tak, aby nedochádzalo ku samovoľnej migrácii biomolekúl difúziou, čo je zabezpečené použitím pevných podkladov, akými sú filtračný papier, celulóza, alebo najčastejšie, gél [1].
Fyzikálny princíp upraviť
Sila Fe, ktorou pôsobí elektrické pole o intenzite E na ión s nábojom q je vyjadrená rovnicou . Opačným smerom pôsobí frikčná sila , kde v je rýchlosť migrujúceho iónu a f tzv. frikčný koeficient, ktorý vyjadruje mieru, ktorou je ión unášaný roztokom a závisí na veľkosti, tvare a stave solvatácie iónu, ako aj na viskozite roztoku. V konštantnom elektrickom poli sú sily vyrovnané:
- ,
takže každý ión sa pohybuje svojou charakteristickou rýchlosťou a je definovaný tzv. elektroforetickou mobilitou μ:
Táto rovnica však platí len obmedzene, pre nekonečne zriedené roztoky iónov a nevodivé rozpúšťadlá. Veľké ióny, ako proteíny, sú v skutočnosti obklopené solvatačnou vrstvou, ktorá vytvára dodatočné elektrické pole ovplyvňujúce jeho mobilitu. Pohyblivosť iónov s acidobázickými vlastnosťami je navyše ovplyvnená pH roztoku [1].
Separácia proteínov upraviť
Papierová elektroforéza upraviť
Pre prevedenie papierovej elektroforézy je vzorka nanesená do malého pásu filtračného papieru, ktorého oba konce sú ponorené do roztokov elektród o opačnej polarite. Po aplikácii elektrického poľa sa ióny pohybujú v závislosti od veľkosti ich náboja (na rozdiel od papierovej chromatografie, pri ktorej sa ióny pohybujú na základe ich polarity). Proteíny sú po rozdelení zobrazované sledovaním rádioaktivity, fluorescenčne alebo zhášaním fluorescencie filtračného papiera [1].
Gélová elektroforéza upraviť
Gélová elektroforéza je v dnešnej dobe veľmi často používaná a prakticky úplne nahradila elektroforézu papierovú. Ióny sa v géli rozdeľujú podľa veľkosti, pričom mobilita väčších iónov je naproti menším zbrzdená. Najčastejšie je používaný polyakrylamidový gél (PAGE, polyakrylamidová gélová elektroforéza), ktorý je vytvorený polymeráciou akrylamidu s N,N'-metylénbisakrylamidom vo vybranom pufri. Pre inicializáciu polymerácie sa používa kyselina peroxosírová a polymeračná reakcia je stabilizovaná zlúčeninou TEMED (N, N, N', N'-tetramethylethylendiamin). Pufer zvykne mať pH okolo 9 a do gélu sa pridáva dodecylsíran sodný (SDS, sodium dodecylsulphate), pričom tieto dva faktory udávajú proteínom záporný náboj a zabezpečujú, aby putovali k anóde. Gél sa zvyčajne necháva stuhnúť medzi dvoma sklami tak, aby na jeho vrchnej strane vznikli jamky pre dávkovanie vzoriek. Zvyčajne sa nad sebou nechávajú stuhnúť dva gély, hustejší zaostrovací (stacking), do ktorého sa dávkujú vzorky a ktorý zabezpečuje ich lepšie zaostrenie a rozlíšenie, a redší rozdelovací (running), v ktorom sa proteíny rozdeľujú. Ako elektródový pufer sa používa rovnaký pufer, z ktorého je tvorený gél.
Do proteínovej vzorky sa pridáva SDS udávajúca proteínom záporný náboj, redukčné činidlo (ditiotreitol, merkaptoetanol), redukujúce disulfidické mostíky, glycerol, ktorý zvyšuje hustotu roztoku (aby sa vzorky ľahko dostali do jamiek a nedifundovali do elektródového roztoku), farbivo (typicky brómfenolová modrá), ktoré vizualizuje časový priebeh elektroforézy a pufer o vhodnom pH [1].
Izoelektrická fokusácia upraviť
Keďže každý proteín má aminokyseliny s reaktívnymi skupinami schopnými odovzdať alebo prijať vodíkový katión, je zároveň každý proteín charakterizovaný svojim izoelektrickým bodom (pI), čo je pH, pri ktorom daný proteín nie je pohyblivý v elektrickom poli. Ak je teda elektroforéza vzorky proteínov prevedená v géli s kontinuálnym gradientom pH, každý proteín sa zastaví pri pH rovnom svojmu pI, čím dochádza k ich separácii.
Farbenie gélov upraviť
Po rozdelení proteínov v elektrickom poli je potrebné ich nafarbiť. Najpoužívanejšie farbivo je Coomassie brilliant blue, ktoré vytvára komplex s proteínom. Gél je najprv máčaný v alkoholovom alebo kyslom roztoku tohto farbiva, čím sa nafarbí celý gél. Následne je nadbytočné farbivo odstránené máčaním gélu v kyslom roztoku, takže nakoniec ostanú nafarbené len proteíny. Coomassie brilliant blue umožňuje detegovať proteíny v množstve do 0,1 μg.
Približne 50x citlivejšou metódou je farbenie striebrom, jeho aplikácia je však náročnejšia. Alternatívnym farbivom je fluorescamín, ktorý reaguje s primárnymi amínovými zvyškami lyzínu. Produkt tejto reakcie silne fluoreskuje pri ožiarení UV žiarením. Rádioaktívne značené vzorky môžu byť zobrazované aj rádiografickými metódami. Pre špecifickú detekciu konkrétneho proteínu môže byť použitá blotovacia metóda (Western blot) [1][2].
Kapilárna elektroforéza upraviť
Hoci je gélová elektroforéza bežná a veľmi efektívna metóda, na jej prevedenie je potrebná minimálne hodina času a je náročná na kvantifikáciu a automatizáciu. Tieto problémy boli prekonané technikou kapilárnej elektroforézy, v ktorej sa proteíny delia vo veľmi tenkej (v priemere 20 – 100 μm) kremennej, sklenenej alebo plastovej kapiláre. Malý priemer kapiláry zabezpečuje rýchly odvod tepla a preto umožňuje použitie desaťnásobne väčšieho elektrického pola oproti gélovej elektroforéze, čo zvyšuje rýchlosť separácie na niekoľko minút a zmenšuje rozmývanie vzoriek difúziou. Kapiláry môžu byť naplnené pufrom, SDS-PAGE gélom, aj amfolytmi (pre izoelektrickú fokusáciu). Proces kapilárnej elektroforézy môže byť od dávkovania až po zbieranie vzoriek plne automatizovaný, podobne ako vysokoúčinná kvapalinová chromatografia. Na druhej strane dokáže kapilárna elektroforéza separovať len malé množstvo materiálu a preto je jej použitie obmedzené len na analytické účely [1]
Separácia DNA upraviť
Elektroforéza sa v prípade DNA môže použiť ako analytická, tak aj preparatívna metóda. Agarózový gél sa pripravuje rozpustením agarózy vo vodivom pufre, v ktorom sú ponorené aj elektródy. DNA má vďaka fosfátovým skupinám záporný náboj a preto putuje k anóde. Farbivo ofarbujúce DNA sa môže vmiešať do gélu ešte pred jeho stužením, alebo sa pridáva ku vzorkám DNA. Najjednoduchším farbivom je etídium bromid, ktorý sa do DNA viaže interkaláciou, jeho používanie je však pre jeho karcinogenitu na ústupe. Namiesto neho sa používajú komerčne dostupné farbivá. Väčšina z nich fluoreskuje pri osvetlení UV žiarením, čo je nevýhodné pre preparatívne účely, pretože UV žiarenie spôsobuje degradáciu DNA [2].
Marker upraviť
Ako marker sa označuje zmes DNA, resp. proteínov o známej veľkosti, ktorá je nanesená vedľa vzoriek do gélu. Na základe rozdelenia známych zložiek markeru je možné približne určiť v prípade DNA počet párov báz a v prípade proteínov molekulárnu hmotnosť [2].
