Polymerázová reťazová reakcia: Rozdiel medzi revíziami

Smazaný obsah Přidaný obsah
→‎Princíp: primer nie je krátky úsek DNA, ale RNA
Pažo (diskusia | príspevky)
d Revert opravy zo správnej na nesprávnu verziu - primer je naozaj DNA - doplnené o citáciu a lepšie vysvetlené.
Riadok 2:
 
== Princíp ==
Princíp PCR je založený na činnosti [[DNA polymeráza|DNA polymerázy]], ktorá amplifikuje (množí) vlákno DNA v smere 5'-3'. DNA polymeráza však nedokáže syntetizovať nové vlákno DNA od začiatku, potrebuje na to tzv. [[primer]], čo je krátky úsek RNADNA, ktorý je presne komplementárny s vláknom DNA, ktoré je potrebné amplifikovať (tzv. templátové vlákno alebo templát <ref name=primer>{{cite journal | last = Valones| first = A.A.V. | priezvisko2 = Guimarães| meno2 = R.L. | priezvisko3 = Brandão| meno3 = L.A.C. | priezvisko4 = de Souza | meno4 = P.R.E. | priezvisko5 = Carvalho | meno5 = A. de A.T. | priezvisko6 = Crovela | meno6 = S. | title = Principles and applications of polymerase chain reaction in medical diagnostic fields: a review. | journal = Braz J Microbiol. | volume = 40 | issue = 1 | pages = 1-11 | year = 2009| language = anglicky }}</ref>; porovnaj s [[replikácia DNA|replikáciou]], pri ktorej [[bunka]] používa ako primer [[RNA]] <ref name=Lehn>{{Citácia knihy | priezvisko = Nelson| meno = David L.| priezvisko2 = Cox | meno2 = Michael M. | titul = Lehninger Principles of Biochemistry| rok = 2013 | vydanie = 6 | miesto = New York | vydavateľ = W. H. Freeman and Company | isbn = 978-1-4641-0962-1 | jazyk = anglicky }}</ref>.). Pre PCR sú teda potrebné dva primery (pre amplifikáciu oboch vláken dvojvláknového DNA) a je potrebné poznať sekvenciu okrajových častí amplifikovaného úseku DNA, aby bolo podľa nej možné navrhnúť a syntetizovať primery. Tie sú v praxi dlhé okolo 18 párov nukleových báz. Ich presná dĺžka sa určuje tak, aby na amplifikovanú DNA (templát) nasadali pri teplote typicky okolo 60 °C (nad touto teplotou primery disociujú). Táto teplota sa nazýva nasadacia teplota (z angl. annealing temperature) a je možné ju vypočítať pomocou prediktorou, z ktorých mnohé sú zadarmo dostupné na internete. Samotná polymerácia DNA polymerázami následne prebieha pri zvýšenej teplote (typicky 72 °C), preto sú pre tieto účely vyuzívané polymerázy izolované z organizmov žijúcich v extrémnych tepelných podmienkach a deriváty týchto polymeráz. Tento cyklus sa opakuje typicky 20 – 40-krát, pričom s každým cyklom rastie množstvo reťazcov DNA exponenciálne. Na začiatku každého cyklu sa navyše reakčná zmes zohrieva na vysokú teplotu (okolo 96 °C), vďaka čomu sa vlákna templátového DNA od seba oddelia a sú v nasledujúcich krokoch prístupné ako primerom, tak aj polymeráze.<ref name=ncbi/>
[[File:Polymerase chain reaction.svg|upright=3.8|frameless|Schematický nákres cyklu PCR]]
=== DNA polymeráza ===