Elektroforéza: Rozdiel medzi revíziami

Gélová elektroforéza je v dnešnej dobe veľmi často používaná a prakticky úplne nahradila elektroforézu papierovú. Ióny sa v gélegéli rozdeľujú podľa veľkosti, pričom mobilita väčších iónov je naproti menším zbrzdená. Najčastejšie je používaný polyakrylamidový gél (PAGE, '''p'''oly'''a'''krylamidová '''g'''élová '''e'''lektroforéza), ktorý je vytvorený polymeráciou akrylamidu s N,N'-metylénbisakrylamidom vo vybranom pufri. Pre inicializáciu polymerácie sa používa kyselina peroxosírová a polymeračná reakcia je stabilizovaná zlúčeninou TEMED (N, N, N', N'-tetramethylethylendiamin). [[PuforPufer]] zvykne mať pH okolo 9 a do gélu sa pridáva dodecylsíran sodný (SDS, '''s'''odium '''d'''odecyl'''s'''ulphate), pričom tieto dva faktory udávajú proteínom záporný náboj a zabezpečujú, aby putovali k anóde. Gél sa zvyčajne necháva stuhnúť medzi dvoma sklami tak, aby na jeho vrchnej strane vznikli jamky pre dávkovanie vzoriek. Zvyčajne sa nad sebou nechávajú stuhnúť dva gély, hustejší zaostrovací (stacking), do ktorého sa dávkujú vzorky a ktorý zabezpečuje ich lepšie zaostrenie a rozlíšenie, a redší rozdelovací (running), v ktorom sa proteíny rozdeľujú. Ako elektródový puforpufer sa používa rovnaký puforpufer, z ktorého je tvorený gél. <br>

Do proteínovej vzorky sa pridáva SDS udávajúca proteínom záporný náboj, redukčné činidlo (ditiotreitol, merkaptoetanol), redukujúce disulfidické mostíky, [[glycerol]], ktorý zvyšuje hustotu roztoku (aby sa vzorky ľahko dostali do jamiek a nedifundovali do elektródového roztoku), farbivo (typicky brómfenolová modrá), ktoré vizualizuje časový priebeh elektroforézy a puforpufer o vhodnom pH <ref name=Voet/>.

Keďže každý proteín má aminokyseliny s reaktívnymi skupinami schopnými odovzdať alebo prijať vodíkový katión, je zároveň každý proteín charakterizovaný svojim [[izoelektrický bod|izoelektrickým bodom]] (pI), čo je pH, pri ktorom daný proteín nie je pohyblivý v elektrickom poli. Ak je teda eletroforézaelektroforéza vzorky proteínov prevedená v gélegéli s kontinuálnym gradientom pH, každý proteín sa zastaví pri pH rovnom svojmu pI, čím dochádza k ich separácii.

Hoci je gélová elektroforéza bežná a veľmi efektívna metóda, na jej prevedenie je potrebná minimálne hodina času a je náročná na kvantifikáciu a automatizáciu. Tieto problémy boli prekonané technikou kapilárnej elektroforézy, v ktorej sa proteíny delia vo veľmi tenkej (v priemere 20 – 100 μm) kremennej, sklenenej alebo plastovej kapiláre. Malý priemer kapiláry zabezpečuje rýchly odvod tepla a preto umožňuje použitie desaťnásobne väčšieho elektrického pola oproti gélovej elektroforéze, čo zvyšuje rýchlosť separácie na niekoľko minút a zmenšuje rozmývanie vzoriek difúziou. Kapiláry môžu byť naplnené pufrom, SDS-PAGE gélom, aj amfolytmi (pre izoelektrickú fokusáciu). Proces kapilárnej elektroforézy môže byť od dávkovania až po zbierainezbieranie vzoriek plne automatizovaný, podobne ako vysokoúčinná kvapalinová [[chromatografia]]. Na druhej strane dokáže kapilárna elektroforéza separovať len malé množstvo materiálu a preto je jej použitie obmedzené len na analytické účely <ref name=Voet/>