Povrchová plazmónová rezonancia

Povrchová plazmónová rezonancia (SPR, z angl. surface plasmon resonance) je rezonančná oscilácia elektrónov na pomedzí vrstiev materiálov o rôznej optickej hustote, vyvolaná elektromagnetickou vlnou spĺňajúcou podmienky rezonancie. Tento jav sa vedecky využíva na meranie miery interakcie dvoch makromolekúl, často polymérov alebo proteínov. Výhodou SPR je, že v porovnaní s inými metódami určenými na meranie interakcie makromolekúl je výstupnou nameranou hodnotou nielen disociačná konštanta vznikajúceho komplexu, ale aj kinetické konštanty jeho vzniku a rozpadu.

Teória

Schéma SPR experimentu

Pre meranie interakcie makromolekúl je v prípade SPR potrebné jednu z nich imobilizovať na tenkej povrchovej vrstve kovu, ktorým je zväčša zlato. To je bežne dosiahnuteľné pomocou tzv. linkeru, čo je organická molekula, ktorá má na jednej strane -SH skupinu interagujúcu so zlatou vrstvou a na strane druhej -COOH skupinu tvoriacu amidovú väzbu s NH2 skupinou proteínu. Dĺžkou uhlíkového reťazca medzi oboma skupinami linkeru je tak možné zvoliť vzdialenosť, akú má imobilizovaný proteín od povrchu kovu. Druhá interagujúca molekula je k prvej vedená v roztoku úzkou kapilárou, takže medzi oboma molekulami sa vytvára dynamická rovnováha. Vlastnosti interakcie sú merané povrchovou plazmónovou rezonanciou, pričom tento jav vzniká po ožiarení interakčnej plochy monochromatickou elektromagnetickou vlnou spĺňajúcou podmienky rezonancie. Jednou z podmienok rezonancie je, že elektromagnetická vlna musí byť p-polarizovaná, čiže polarizovaná rovnobežne s rozhraním kovu a skla. Hlavnou podmienkou rezonancie je tzv. úplný odraz, ktorý môže nastať iba pod uhlom nižším, ako medzným uhlom dopadu. Takýto uhol je možný iba v prípade, ak elektromagnetické žiarenie prichádza z prostredia s vyšším indexom lomu do prostredia z nižším indexom lomu. Z tohto dôvodu je kovová vrstva položená na sklenenom bloku, z ktorého prichádza elektromagnetické žiarenie. Po dopade žiarenia na kovovú vrstvu za dodržania podmienok rezonancie sú týmto spôsobom vyvolané dva fyzikálne javy. Jedným je vznik evanescenčnej vlny, čo je postupne miznúca vlna šíriaca sa na hranici skla a kovu. Druhým je povrchový plazmón, čo je vlna oscilujúcich elektrónov vznikajúca na hranici skla a kovu, ktorá spôsobuje na danom mieste absorpciu elektromagnetického žiarenia v priamej v závislosti na rozdiele v indexe lomu medzi sklom a kovom.

Časový signál meraný pri SPR experimente

Meraným signálom je teda buď zmena intenzity odrazeného paprsku elektromagnetického žiarenia v dôsledku jeho absorpcie povrchovým plazmónom alebo zmena uhlu dopadujúceho paprsku v dôsledku zmeny rozdielu indexu lomu medzi kovom a sklom. Meranie interakcie týmto spôsobom je umožnené tým, že prítomnosť naviazanej molekuly na povrchu kovu mení optické vlastnosti kovu a teda aj jeho index lomu. Preto dochádza k zmene signálu najprv po naviazaní prvej makromolekuly na povrch kovu a potom tvorbe komplexu oboch makromolekúl.

Výhody a nevýhody

Metóda merania povrchovej plazmónovej rezonancie prináša niekoľko výhod, vďaka ktorým je vo vede používaná často. Okrem nízkej ceny ide hlavne o možnosť merania kinetických väzbových konštánt k_on (rýchlostná konštanta vzniku komplexu) a k_off (rýchlostná konštanta zániku komplexu), ktorých pomer k_on/k_off je disociačná konštanta K_D. Pomocou ostatných metód určených na štúdium interakcie makromolekúl je možné merať iba priamo disociačnú konštantu, ktorá je relevantná z hľadiska stability komplexu, nie však z hľadiska afinity dvoch interakčných makromolekúl. Nevýhodou metódy je uchytenie jednej z makromolekúl na povrchu kovovej vrstvy. To spôsobuje, že sa táto makromolekula v roztoku nepohybuje úplne voľne a nemôže zaujať všetky možné konformácie vzhľadom k druhej makromolekule, preto je vhodné dáta namerané pomocou SPR porovnávať s podobnými dátami.